【實驗原理】

將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理，分散成單細胞，置于合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。

原代細胞保留了很多來源組織的重要生理特性，能高度模仿體內(nèi)的情況，且沒有遺傳和化學的改變。因此，原代細胞成為許多研究中理想的細胞模型。

【應用簡介】

凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。通過原代分離獲得的細胞具有與體內(nèi)細胞相似的生物學特征，是研究生物體相關生命活動的理想材料。

【實驗方法】

（一）懸浮細胞的分離方法

組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。

（二）實體組織材料的分離方法

對于實體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機械分散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結構松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。

（三）小鼠肝細胞原代培養(yǎng)

1、取肝臟：將小鼠斷頸致死，取肝臟；

2、除雜物：剔除脂肪、結締組織、血液等雜物； 

3、研磨肝臟：用手術剪將臟器剪成小塊并研磨；

4、胰酶消化：加入胰酶消化，使細胞分離；

5、濾網(wǎng)去雜：用濾網(wǎng)過濾，除去大組織塊； 

6、細胞計數(shù)：血球計數(shù)板計數(shù)。

【樣本送檢要求】

【案例展示】

【常見問題】

（1）原代培養(yǎng)材料的選擇，盡量選取繁殖能力較強的組織，如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。

（2）要注意無菌操作。其操作要求應高于外科手術、

（3）整個取材操作要迅速，時間不能過長，以確保胚胎細胞活性。

（4）運用消化法時胰酶溫度應低于37℃，濃度只需平時消化細胞濃度的一半。因為此過程不像消化培養(yǎng)細胞時的1~10min，而是至少20min，先消化下來的細胞在此胰酶消化液中繼續(xù)消化了10min以上。所以胰酶不能作用過強，否則這些細胞易被損傷而不易生存。

（5）如使用組織塊法，則應待組織塊略干燥，能黏附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸，匆使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有黏壁，則細胞不易生長，即使生長也因沒有貼在瓶壁上，從而因不能觀察到而無法收集到生長的細胞。

（6）原代培養(yǎng)操作時，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。

【服務流程】